产品货号：
BTN70606
中文名称：
一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装
英文名称：
One-Stop miRNA Urea-PAGE Pack
产品规格：
30次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒提供了miRNA尿素-PAGE电泳所需要的成套试剂，即开即用，十分方便，免去了实验人员称取有毒物品。
尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离200nt以下的小片段RNA，尤其是20nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐。
保存：包装一常温保存，包装二-20℃保存，有效期1年。
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尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离200nt以下的小片段RNA，尤其是20nt左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐。
- 灵活，可以根据需要配制各种浓度的Urea-PAGE，以便对长度各异的RNA进行电泳。
- 电泳后可直接用于UV观察、银染、胶回收、Northern杂交等实验。
- 使用新型上样缓冲液，可以防止甘油的干扰。
| 包装 | 组分 | 规格 |
| 包装一 | 尿素 | 2×105g |
| 丙烯酰胺，电泳级 | 60g | |
| 甲叉双丙烯酰胺，电泳级 | 3g | |
| TBE电泳液，10× | 250mL | |
| TEMED | 1.5mL | |
| 过硫酸铵 | 1g | |
| 固相RNase清除剂 | 250mL | |
| 包装二 | 2×miRNA尿素-PAGE上样液 | 1.5mL |
| miRNA电泳标准 | 150μL |
保存：包装一常温保存，包装二-20℃保存，有效期1年。
- 准备工作：
- 用固相RNase清除剂清洁工作平台
直接将固相RNase清除剂原液或10倍的新鲜稀释液喷于台面，5分钟后用普通吸水纸擦净，最后用沾有固相RNase清除剂1000倍新鲜稀释液的吸水纸擦净，晾干。 - 用固相RNase清除剂清洁玻璃和塑料器皿
将器皿浸泡在固相RNase清除剂的10或100倍的新鲜稀释液中，静置处理5分钟后取出，再用固相RNase清除剂1000倍或10000倍新鲜稀释液浸泡二次以上，倒立晾干后备用。
- 用固相RNase清除剂清洁工作平台
- 配制1×TBE电泳液：
将适量的10×TEB电泳液用RNase-free水稀释10倍，得到1×TBE电泳液待用。此溶液需要现用现配，否则易长菌。 - 配制10%过硫酸铵溶液：
精确称取约100mg过硫酸铵到一干净的1.5mL离心管中，按每1mg过硫酸铵加10μL RNase-free水的比例加入RNase-free水，摇晃溶解待用。10%过硫酸铵溶液有效期不要超过一周。 - 估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块13cm×15cm×0.8mm的胶需要15mL凝胶溶液，配制一块36cm×45cm×0.8mm的胶需要120mL凝胶溶液。
- 配制40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：
将3g甲叉双丙烯酰胺全部倒入装有60g丙烯酰胺干粉的瓶中，加入130mL自备的RNase-free水，充分摇晃混匀即得40%的Acrylamide/Bis（20:1）溶液。 - 根据所需要的凝胶溶液的体积，在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分（此处以配制100mL Acrylamide/Bis终浓度为15%的凝胶为例）:
成分 用量 终浓度 尿素 42g 7M 40% Acrylamide/Bis溶液 37.5mL 15% 10×TEB电泳液 10mL 1× RNase-free水 至100mL -
Acrylamide/Bis的终浓度需要根据待分离RNA长度选择(见下表)。需分离的RNA长度范围 Acrylamide/Bis终浓度 6～100nt 20% 25～150nt 15% 40～200nt 12% - 搅拌并加热到40～50℃左右，直到尿素完全溶解。
- 冷却到室温后，将三角瓶接上真空系统抽真空处理10～15分钟以充分去除溶液中的氧气（氧气会降低聚合反应效率）。若条件有限，此步可省略。
- 边摇晃溶液变加入50μL TEMED和500μL 10%过硫酸铵溶液。注意：如果选择其他工作浓度的Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要随之改变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化，此二成分的用量要按比例改变。
- 再充分摇晃约30秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置30～60分钟等待胶凝固。
- 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的1×电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。
- 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。
- 在上样前，预电泳20～30分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可以使凝胶的温度升高（到50℃左右），有利于RNA变性状态。
- 将5μL miRNA样品与和5μL miRNA电泳标准分别和5μL的2×miRNA上样液混合，70℃保温2～3分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。可以增加miRNA样品的用量，但上液需要等比例增加。
- 关电泳仪后开始上样。10μL混合液需要全部上样。
- 重开电泳仪，对13cm×15cm的胶，以20-30mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止；对36cm×45cm的胶，则以50-60mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。
- 染色观察：
将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色，包括银染（需单独购买试剂盒）、EB染色（每100mL 1×TBE中加20μL 10mg/mL的EB溶液）、低毒核酸染料染色（每100mL 1×TBE中加10μL低毒核酸染料）。如果用后两种染色法染色，需要在UV下观察并拍照。本产品提供的miRNA Marker有5条带，从上到下的长度分别为：50nt、40nt、30nt、20nt和15nt。 - 其它后续处理（本试剂盒不含所需试剂），流程仅仅供参考。
- miRNA回收：
在UV下确定所需要的miRNA条带的位置，切胶后进行胶回收处理（需要单独购买试剂盒）。 - Northern杂交：
UV观察后将凝胶中的RNA电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。 - 放射自显影：
如果miRNA样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保鲜膜，真空抽干，然后使胶跟X光片向对置进行放射自显影。
- miRNA回收：
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